今天和大家分享一下贴壁细胞培养的注意事项以及实验中常见问题的解决方法。
1.恢复
复苏的细胞应迅速解冻
1. 将水浴加热至 37°C。
2. 将冻存管从液氮或冰柜中取出，立即放入37℃，轻轻摇晃至融化，取出，用酒精棉球擦拭后放入超净工作台。
3. 用移液器吸出细胞悬液至装有10ml 培养基的离心管中， 5 分钟。整个操作的速度应尽可能快，以减少细胞在含有冷冻保存液的培养基中的储存时间。
4.吸取上清液，加1ml培养基重悬细胞，将细胞悬液加入5ml培养瓶中，再向培养瓶中加入培养基至5ml。操作过程中尽量轻柔。
5、在培养瓶侧面标明细胞种类、实验日期等，置于细胞培养箱中离心瓶，每隔一天观察细胞是否贴壁存活。
2. 培养基
培养基的选择取决于细胞的类型。贴壁细胞一般使用DMEM培养基。
1. DMEM-高糖（标准型）
含葡萄糖/升，适用于多种哺乳动物细胞培养，更适合高密度悬浮细胞培养。贴附性差，但又不想脱离原生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤和DNA转染转化细胞的骨髓瘤细胞培养。
2. DMEM-低糖（标准型）
含有葡萄糖/L，用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适用于依赖性贴壁细胞的培养，尤其适用于生长快、贴壁差的肿瘤细胞的培养。
3. DMEM/F12
DMEM/F12培养基适用于菌落密度培养。F12培养基成分复杂，含有大量微量元素。它以1:1的比例与DMEM结合，称为DMEM/F12培养基（DMEM/）。DMEM 的优点是含有更高浓度的营养物质。DMEM/F12培养基适用于低血清含量条件下哺乳动物细胞的培养。后来通过向 DMEM/F12 (1:1) 添加缓冲区来提高其缓冲能力。
3.血清
一般可根据ACTT和实验要求选择所用血清的种类。
1、我国2000年版《生物制品主要原辅料质量控制标准》突出了对牛血清质量标准的比较严格。包括蛋白质含量、细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌、细菌内毒素、支持细胞增殖检查。血清分为：
a) 新生牛血清（取自10-14天内的新生牛犊的血液）；
b) 小牛血清（10个月以内的小牛血液）；
c) 胎牛血清（剖腹产制备）。
2.三种血清的区别：
三种血清的成分没有显着差异。胎牛血清是最高质量的。胎牛血清和新生牛血清的成分和比例不同，主要是细胞生长促进因子、粘附促进因子、激素等活性物质的成分和比例不同。由于生长发育的需要，小牛出生后某些成分会发生一些变化，胎牛血清中某些功能蛋白的含量与小牛血清中的有所不同。
三、血清储存和使用注意事项
血清应在-5℃至-20℃保存，4℃保存不宜超过1个月。解冻血清时，将血清放入2-8℃的冰箱中，经常摇动使其溶解，然后置于室温下升温。请勿将其直接置于 37°C 水浴或培养箱中。如果在37℃解冻，颜色会加深，粘度也会增加。解冻、热熄灭后离心瓶，血清应按使用量分装，-20℃保存。使用过程中避免反复冻融。
4.继承
（细胞附着过程来自网络）
1、实验准备，在超净台上喷洒酒精，用紫外线照射30分钟。准备培养瓶/皿、离心管、10% DMEM、0.25%胰蛋白酶、D-hanks溶液等，戴上手套、口罩等。
2. 倒掉旧培养基，用D-hanks溶液清洗，去除沉积的死细胞等。
3、加入2ml 0.25%胰蛋白酶消化液，消化2-3分钟，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩出现空隙时倒掉酶液。
（细胞消化情况来自网络）
4. 加入1～2滴含血清的培养基，反复吸取细胞形成细胞悬液。
5. 1:2或1:3分装，补充新鲜培养基，在培养瓶上标明代号和日期，轻轻摇晃，置于37°C CO2培养箱中培养。
6、细胞培养24小时后，可以观察培养基的颜色和细胞的生长情况。
7. 必须仔细监测贴壁细胞的生长，以确保细胞保持健康。根据细胞类型的不同，许多贴壁细胞在达到 70-90% 密度时需要传代，覆盖 70-90% 的培养容器表面。尽管这些细胞系保留了原始细胞来源的许多特征，但每次传代也会使它们开始发展出扩增细胞所独有的一些特征。因此，对于任何给定的细胞系，请考虑限制通道数。
8. 许多贴壁细胞系可以自然地附着在未包被的塑料上。因此，细胞传代常采用培养皿或六孔板等塑料细胞培养板。塑料细胞培养瓶也比较常用，如T25细胞培养瓶，常用于少量细胞的扩增培养或开始培养生长缓慢的细胞系。T75细胞培养瓶常用于培养扩增速度较快的细胞系或大量培养超过T25培养瓶容量的细胞。
9.转移贴壁细胞时，先切掉细胞上与塑料结合的蛋白质。因此，消化酶胰酶常被用来消化细胞。控制胰蛋白酶化的时间很重要，因为长时间的处理会损坏细胞表面蛋白。
10、细胞培养基能中和胰蛋白酶。因此，细胞通常在胰蛋白酶消化前用磷酸盐缓冲盐水或 PBS 清洗。EDTA 是一种钙螯合剂，有时也用于增强胰酶的蛋白水解功能。
11、为扩大细胞克隆，将刚传代的细胞置于细胞培养箱中培养，选择适合细胞生长的条件，通常温度为37度，二氧化碳为5%，湿度为95%。
本期贴壁细胞培养注意事项及相关问题解答到此结束。如果您有任何问题或建议，请咨询下方小助手。祝大家实验顺利，早日拿到论文！
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